何謂常規(guī)反相色譜柱？
在硅膠或雜化基質(zhì)顆粒上鍵合了如C18、C8、C4或苯基等鍵合相的色譜填料所裝填的色譜柱，按反相色譜條件進(jìn)行操作和分離。反相是液相色譜中常使用的分離模式，而C18柱是常使用的反相色譜柱之一。
新色譜柱開(kāi)啟和安裝的推薦步驟：
使用新鮮潔凈的水與乙腈。沖洗系統(tǒng)，確保系統(tǒng)干凈，不含任何緩沖鹽和污染物。
取用色譜柱時(shí)避免磕碰掉落。
將色譜柱入口端連接到系統(tǒng)上，柱出口端先不要連接，色譜柱身上有箭頭標(biāo)明正確流向。
在0.1 mL/min流速條件下用純乙腈潤(rùn)洗色譜柱，然后在2分鐘內(nèi)將流速升至0.5 mL/min。
當(dāng)溶劑均勻的從柱出口端流出，停流速，將色譜柱出口端接到系統(tǒng)檢測(cè)器上（這樣可以避免氣泡進(jìn)入檢測(cè)系統(tǒng)，并且可快速達(dá)到基線平衡）。
重啟流速，按照步驟4的方法逐漸提高流速，至常規(guī)分析時(shí)所使用的流速。
參考柱效測(cè)試報(bào)告中的方法，使用該流動(dòng)相條件平衡色譜柱，通常需要使用5-10倍柱體積的流動(dòng)相，直至壓力與基線穩(wěn)定。
測(cè)試柱效。如果沒(méi)有柱效測(cè)試報(bào)告中的分析物，請(qǐng)聯(lián)系沃特世化學(xué)消耗品部門尋求支持，使用合適的濃度與進(jìn)樣量。柱效結(jié)果略低于柱效測(cè)試報(bào)告屬正常情況。如結(jié)果明顯偏低、峰形拖尾，提示色譜柱和/或所使用的液相系統(tǒng)處于非理想狀態(tài)，需要進(jìn)行故障排查。
當(dāng)使用2.1 mm內(nèi)徑色譜柱時(shí)，建議優(yōu)化系統(tǒng)以減少譜帶展寬，包括：使用檢測(cè)器微量流通池，減少進(jìn)樣器loop環(huán)體積，使用較小內(nèi)徑（如0.005''或0.12 mm）的系統(tǒng)管路。并確保管路與色譜柱連接恰當(dāng)、無(wú)死體積。
當(dāng)使用小顆粒填料（如2.5 μm）短柱進(jìn)行高效快速分離時(shí)，需要考慮以下因素：
確保管路與色譜柱連接恰當(dāng)、無(wú)死體積，盡量?jī)?yōu)化系統(tǒng)減少譜帶展寬；
提高采樣頻率至10點(diǎn)/秒以上；
較小粒徑的色譜柱產(chǎn)生的柱壓較高，而較小粒徑要達(dá)到理想色譜效率所需的線速度較高，請(qǐng)根據(jù)所用LC系統(tǒng)的實(shí)際情況調(diào)節(jié)流速；
可使用較高的柱溫來(lái)補(bǔ)償小顆粒造成的壓力升高，例如40?C。使用雜化顆粒反相色譜柱時(shí)，可使用45?C或更高。
進(jìn)行實(shí)際樣品分析的推薦步驟：
確保流動(dòng)相潔凈，每隔24-48小時(shí)就應(yīng)新配水相流動(dòng)相，并同時(shí)更換或仔細(xì)清洗流動(dòng)相溶劑瓶，以避免流動(dòng)相長(zhǎng)菌。確保實(shí)驗(yàn)室純水系統(tǒng)工作正常。
確保樣品不含顆粒型雜質(zhì)。如樣品過(guò)臟，或有微粒存在，需要考慮適合的樣品制備方法。在使用樣品過(guò)濾器時(shí)，確保濾膜為0.22 μm，且與樣品溶劑完全兼容（不發(fā)生溶解）。也可考慮使用高速離心法去除顆粒性雜質(zhì)，例如8000 rpm轉(zhuǎn)速以上離心20分鐘后，移取樣品上清液進(jìn)樣。
確保樣品溶液與流動(dòng)相條件兼容，進(jìn)樣后不會(huì)發(fā)生沉淀、或溶劑不互溶情況。通常使用流動(dòng)相或比流動(dòng)相洗脫強(qiáng)度弱的溶液（即有機(jī)溶劑比例較低）溶解或稀釋樣品，這樣可以獲得優(yōu)異的峰形和檢測(cè)靈敏度。
如系統(tǒng)在線混合生成流動(dòng)相，預(yù)先檢查流動(dòng)相各組分的兼容性。例如，當(dāng)磷酸鹽緩沖液與高濃度乙腈（例如≥70%）混用時(shí)，可能發(fā)生鹽析出。
了解色譜柱的操作使用限度。如果所使用的流動(dòng)相條件、柱溫、以及樣品溶液條件，不利于色譜柱壽命時(shí)，請(qǐng)使用保護(hù)柱以延長(zhǎng)柱壽命。
在使用流動(dòng)相進(jìn)行柱平衡之前，如果流動(dòng)相中含有可能析出的緩沖鹽，先使用5倍柱體積的有機(jī)溶劑-水溶液進(jìn)行過(guò)渡。例如，在使用40/60 甲醇/磷酸鹽緩沖液流動(dòng)相之前，先使用5倍柱體積的40/60 甲醇/純水溶液沖洗色譜柱。
在常規(guī)分析過(guò)程中，每針或間隔若干針清洗柱內(nèi)可能積累的污染物。完成分析后，徹底清洗色譜柱，除去柱內(nèi)緩沖鹽和污染物。
在色譜柱使用過(guò)程中，定期進(jìn)行柱效測(cè)試，記錄塔板數(shù)與壓力，從而追蹤監(jiān)控色譜柱的性能變化。柱效測(cè)試方法應(yīng)固定。
反相色譜柱應(yīng)保存于合適的高比例或100%有機(jī)相（如乙腈或甲醇）中。如色譜柱使用于高溫或極端PH條件，或停用色譜柱超過(guò)72小時(shí)，用100%乙腈保存色譜柱。
使用原配的柱堵頭，確保堵頭擰緊以避免柱內(nèi)溶劑揮發(fā)。取放色譜柱時(shí)避免磕碰掉落。
柱清洗與再生的推薦步驟：
壓力升高，色譜柱峰形發(fā)生變化如出現(xiàn)嚴(yán)重拖尾、肩峰甚至峰分岔，分離度降低，這些都強(qiáng)烈提示色譜柱受到污染?？刹捎靡韵虏襟E處理：
如系統(tǒng)接有在線過(guò)濾器和保護(hù)柱，首先排查在線過(guò)濾器與保護(hù)柱，進(jìn)行更新替換。日常操作中，當(dāng)壓力升高10%或柱效降低10%時(shí)，就應(yīng)考慮更換在線過(guò)濾器和/或保護(hù)柱。
使用高比例的有機(jī)溶劑進(jìn)行沖洗（請(qǐng)注意避免鹽析出，通?？墒褂锰荻壬叻ǎ缓缶S持在高比例甚至100%有機(jī)溶劑條件下）。此操作通?？上慈ゴ蟛糠治廴疚?。
如有機(jī)溶劑清洗不能解決問(wèn)題，可采用如下方法進(jìn)行色譜柱的清洗和再生。根據(jù)樣品性質(zhì)以及你所了解的污染物性質(zhì)選擇清洗方法，用20倍柱體積（即，對(duì)于4.6x250 mm柱，相當(dāng)于80 mL）的HPLC級(jí)溶劑清洗色譜柱，將流動(dòng)相溫度升至35-55?C可提高清洗效率。
極性樣品 | 非極性樣品 | 蛋白質(zhì)類樣品 |
1.水 | 1.異丙醇* | 選擇1：連續(xù)進(jìn)幾針DMSO（二甲基亞砜），以溶解柱頭析出樣品。 |
2.甲醇 | 2.THF** | |
3.THF** | 3. 二氯甲烷** | 選擇2：10-90% B梯度沖洗，其中A為0.1% TFA水溶液，B為0.1% TFA乙腈。 |
4.甲醇 | 4. 正己烷** | |
5.水 | 5. 異丙醇* | 選擇3：使用7M鹽酸胍或7M尿素水溶液(配制后膜過(guò)濾)沖洗色譜柱，促使柱上吸附蛋白樣品變性溶解。 |
6.流動(dòng)相 | 6. 流動(dòng)相 |
* 注意防止緩沖鹽析出，可調(diào)整為適當(dāng)比例的異丙醇和水的混合溶液
** 除非確保您的系統(tǒng)與四氫呋喃和正己烷完全兼容，否則四氫呋喃或正己烷只有在色譜柱無(wú)法用反相有機(jī)溶劑如乙腈清洗干凈時(shí)才考慮使用。降低流速及操作溫度，并盡量減少系統(tǒng)在四氫呋喃和正己烷中的暴露時(shí)間。
可以考慮對(duì)色譜柱進(jìn)行倒沖，特別是當(dāng)問(wèn)題表現(xiàn)為壓力急劇升高，提示有顆粒型物質(zhì)直接堵塞于色譜柱入口端篩板處時(shí)。操作時(shí)，將色譜柱倒接，并與檢測(cè)器斷開(kāi)。使用低流速0.2 ml/min，進(jìn)行過(guò)夜沖洗，并封堵檢測(cè)器入口及出口端以免溶劑揮干產(chǎn)生氣泡。甚或，將色譜柱小心的打開(kāi)，直接更換柱入口端篩板。注意！這類操作需要技巧，僅作問(wèn)題確實(shí)無(wú)法得到有效解決時(shí)的最后嘗試，或供某些經(jīng)驗(yàn)豐富的分析操作人員參考使用。
